简介
DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)，即变性梯度凝胶电泳，是根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。具体而言，就是将特定的双链DNA片段在含有从低到高的线性变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，随着电泳的进行，DNA片段向高浓度变性剂方向迁移，当它到达其变性要求的最低浓度变性剂处，双链DNA形成部分解链状态，这就导致其迁移速率变慢，由于这种变性具有序列特异性，因此DGGE能将同样大小的DNA片段很理想地分开，它是一种很有用分子标记方法。现已广泛应用于生物多样性调查、亲缘关系鉴定、基因突变检测等多个领域。
编辑本段DGGE的基本原理
DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis变性梯度凝胶电泳)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。
编辑本段DGGE主要步骤
DGGE对微生态的分析一般包括三个步骤：核酸提取、16SrRNA序列的PCR扩增以及DGGE指纹图谱分析。有些学者通过克隆、测序建立微生物区系的16SrRNA/DNA文库，通过系统发育分析，建立进化树，从而获得微生物多样性信息，但这种方法相对于指纹图谱技术来说，费时费力，价格也相对昂贵。
核酸提取
微生物总DNA的提取是整个分子生物学技术的基础,是否能获得具有代表性的总DNA样品将决定后续分析的可行性。一般认为微生物提取总DNA的方法分为细胞裂解和核酸抽提两个步骤。细胞裂解有三种:机械法、化学法和酶法。机械法包括玻璃珠法、超声波法、冻融法等;化学法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。而许多研究者用其中两种或三种方法进行组合,发现组合后提取总DNA 的效果较好。Stahl等(1988)在含有SDS和酚的体系中加入适量的玻璃微珠,机械法裂解瘤胃样品中的菌体细胞。Zhu等用酶法和玻璃珠相结合的方法提取鸡盲肠内容物的微生物总DNA。核酸抽提一般用酚- 氯仿- 异戊醇抽提,这种方法对去除杂蛋白有良好的效果。Reichardt等(1994)认为, CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法也是常用的方法。不需要贵重仪器,操作较为简单,能广泛适用于各种植物的核酸提取,纯度也能满足许多分子生物学操作的要求,所以使用日趋广泛。
16SrRNA基因序列的PCR扩增
细菌按沉降系数分为5S、16S和23S三种,16SrRNA基因是细菌染色体上编码该rRNA的相应DNA系列。16SrRNA基因序列全长1540bp ,有保守区和可变区之分,每种细菌的保守区都是相同的,能反映生物种类的亲缘关系,为系统发育重建提供线索;可变区因细菌种类而异,通过保守区设计引物,扩增出可变区,就可以得知微生物多样性信息。大多数情况下,可根据16SrRNAV3区和V6-V8区设计细菌特异性引物进行PCR扩增,有时为了更加准确得获得微生物多样性的信息,可先通过细菌16SrRNA序列全长通用引物进行PCR扩增,再对V3或V6-V8区进行扩增。Yu等的研究表明,通常使用16S的V3区进行PCR扩增后进行DGGE分析,如果所测的序列长度比较长时,也可以使用16S的V3-V5或V6-V8区。
DGGE指纹图谱分析
目前,DGGE电泳图谱的分析最常用的是相似性聚类分析法。DGGE 胶通过扫描仪输入计算机,通过Molecular Analysis软件进行相似性分析。通过DGGE后得到的指纹图谱,每一个条带代表某个微生物优势菌群,通过测序和序列比对,可以得出此优势菌群的种类。
